Хроматография.
Одной из основных задач биохимии, и липидологии в частности, является разделение и идентификация химических соединений. Хроматография — очень эффективный метод для достижения этой цели. Общеизвестно, что метод был разработан в 1906 г. русским ботаником Михаилом Цветом, который разделял растительные пигменты (отсюда и название); однако следует отметить, что в 1855 г. немецкий химик Карл Рунге применил хроматографию на бумаге для разделения неорганических веществ. Более того, Плиний Старший сообщал о разделении красителей на папирусе и существовании хроматографического теста на железо с использованием папируса. Все же хроматография стала по-настоящему серьезным методом только в 1944 г., после работ Арчера Мартина и Джона Синджа, получивших Нобелевскую премию за разработку методологии распределительной хроматографии.
В настоящее время известно большое число различных видов хроматографии (адсорбционная, распределительная, ионообменная, на молекулярных ситах) и различных приемов их применения (колоночная, на бумаге, тонкослойная, газовая). Это обусловлено тем, что хроматография может использоваться для решения разнообразных задач, начиная от получения относительно больших количеств чистого вещества и кончая аналитическими процедурами, позволяющими идентифицировать какие-либо вещества.
Теоретические основы
распределительной хроматографии.
Сильно различающиеся между собой вещества, например железные опилки и частицы стекла, легко можно разделить с помощью магнита; сахар и песок разделяются путем растворения сахара в воде. Однако, если вещества обладают сходными физическими и химическими свойствами, процесс разделения сильно усложняется. Принцип хроматографии состоит в том, что вещества помещают в систему, которая содержит два физически различных компонента — подвижную и неподвижную (стационарную) фазы и в которой разделение по типам молекул происходит за счет различий (часто весьма незначительных) в распределении между этими двумя фазами. Относительная подвижность каждой молекулы зависит от соотношения между движущей силой, которой здесь является движение подвижной фазы, и силами удерживания, к которым в первую очередь следует отнести распределение и адсорбцию.
В распределительной хроматографии принята следующая терминология. Стационарная фаза называется сорбентом. Если сорбент представляет собой жидкость, которая удерживается какимлибо твердым телом, это тело носит название носителя или матрицы. Подвижная фаза называется растворителем или проявителем, а компоненты разделяемой смеси — растворенными веществами.
Распределительная хроматография основана на следующем:
еcли две фазы находятся в контакте друг с другом, причем одна из них или обе содержат растворенное вещество, это вещество будет распределяться между двумя фазами. Этот процесс именуется распределением и количественно описывается коэффициентом распределения, представляющим собой отношение концентраций растворенного вещества в каждой из двух фаз.
Рассмотрим распределительную хроматографию на колонке, где колонкой служит трубка, заполненная сорбентом и растворителем. Раствор, содержащий разделяемую смесь, вводят в колонку так, чтобы растворенные вещества проникли в сорбент. Затем через колонку пропускают растворитель. Хотя сорбент и растворитель распределены по всей колонке равномерно, колонку можно рассматривать как совокупность множества отдельных слоев («теоретических тарелок»), каждый из которых содержит две фазы. Представим, что 256 идентичных молекул,которые равномерно распределяются между неподвижной и подвижной фазами, введены в колонку с 18 теоретическими тарелками (верхний рисунок справа далее по тексту). В верхней теоретической тарелке (начальной) 256 молекул распределены так, что в каждой фазе находится по 128 молекул. При переходе 128 подвижных молекул с первой теоретической тарелки па вторую они распределяются на ней по 64; оставшиеся на первой теоретической тарелке 128 молекул перераспределяются по 64 в каждой фазе, как показано на рисунке. При продвижении подвижных фаз еще на одну теоретическую тарелку снова происходит перераспределение. После 20 последовательных переносов достигается состояние, изображенное на рисунке. Предположим, что на первой теоретической тарелке находится 256 молекул другого типа (на рисунке цифры снаружи колонки), которые в 3 раза больше распределяются в неподвижную фазу. На рисунке показано также их распределение после 20 переносов. Распределение этих двух видов молекул сильно различается, поэтому в результате отделяется значительная часть молекул. Чем больше число теоретических тарелок (т. е. длина колонки), тем лучше разделение. Следует отметить, что при увеличении числа теоретических тарелок вещество распределяется по большей части колонки. В действительности, когда число молекул огромно (т. е. больше 1016), число молекул на первой теоретической тарелке отличается от нуля. С другой стороны, степень распределения уменьшается в том смысле, что большая доля вещества находится на небольшой части теоретических тарелок. Например, после 8 переносов 40% молекул, которые на рисунке распределяются 1:1, содержится в 4/8 теоретических тарелок, после 20 переносов 40% содержится уже в 6/16, или 3/8, теоретических тарелок. Отсюда ясно, что в идеальном случае, когда разделение определяется только распределением, разделение двух веществ будет более эффективным при увеличении длины колонки.
Примеры распределительной хроматографии.
Чаще всего используют два типа распределительной хроматографии — хроматографию на бумаге и тонкослойную. В обоих случаях носитель содержит связанную жидкость: молекулы воды связаны с целлюлозой при хроматографии на бумаге, а при тонкослойной хроматографии с носителем связан растворитель, используемый для получения тонкого слоя. (Эти методы иногда рассматривают как
разновидность адсорбционной хроматографии, поскольку степень разделения зависит и от эффектов адсорбции, однако основным процессом здесь является распределение.) Другим примером распределительной хроматографии служит газожидкостная хроматография.
|
Источник.
Д. Фрайфелдер Физическая биохимия // М.: Мир., 1980, с. 172-175.
Принцип действия колонки, в которой разделение основано на распределении.
Колонка произвольно разделена на 18 теоретических тарелок. На колонку нанесено 512 молекул. Из них 256 (жирный шрифт) распределяются поровну между подвижной фазой (прямой шрифт) и неподвижной фазой (курсив); это категория 1:1. Категория 1:3 (тонкий шрифт) распределяется таким образом, что в подвижной фазе находится 25%, а в неподвижной — 75% молекул. При переносе все вещества в подвижной фазе переходят на следующую теоретическую тарелку. После каждого переноса число молекул каждой категории перераспределяется в соответствии с правилом 1:1 и 1:3.
График показывает распределение каждой категории молекул после 20 переносов. Заметим, что вещество категории 1:3 медленнее движется через колонку.
|
